Мене часто питають про вірусне навантаження при хронічному вірусному гепатиті С, як воно діє, від чого залежить, як змінюється при терапії з сучасними препаратами і як воно впливає на результат. В цій статті я представив власне дослідження цього параметру. Дані були зібрані у відділі вірусних гепатитів Інституту епідеміології та інфекційних хвороб НАМН України. Подяка ст.н.с. відділу Мартинович Т.Л. за допомогу в наборі даних.    

Вірус гепатиту С (HCV) вразив приблизно 3% населення світу, це близько 170 мільйонів чоловік хронічно інфікованих людей. Щорічно більше, ніж 350 000 смертей від цирозу печінки і гепатоцелюлярного карциноми (1).

HCV це РНК вірус з позитивною ланцюгом, який відноситься до роду Hepacivirus у сімействі Flaviviridae (2). Він поділяється на 6 генотипів і його полімераза призводить до більше 50 підтипів (3). Довга відкрита рамка зчитування, яка кодує поліпротеїни HCV, обробляється білками хазяїна і вірусними протеазами і синтезує три структурних білка (капсидний білок ядра і оболонки гликопротеїнів E1 і E2) та семи неструктурних (NS) білків (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A і NS5B) (4). NS2 і p7 необхідні для складання вірусів, але не РНК, тоді як NS3-NS5B беруть участь у формуванні мембранно- асоційованго РНК-реплікативного комплексу (RC) (5). білок NS3 складається з серинових протеази і РНК-гелікази / нуклеозида тріфосфатаза (NTPase), NS4A служить кофактором для NS3 серин-протеази (6), NS5B є РНК-залежною РНК-полімеразею (7), і NS5A, як вважається, грає ключові ролі в декількох етапах життєвого циклу ВГС. NS5A є фосфопротеин з 450 амінокислот, що складається з N-термінальною амфіпатичною на три домена ( I - III), кожен з яких здатний зв'язуватися незалежно від 3’’ региона (UTR) вірусного геномно позитивного ланцюжка РНК. Домен I NS5A необхідний для реплікації РНК і модулює взаємодію між NS5A і ендоплазматичним ретикулумом (ER) (8, 9). Домени II і III пов'язують пептидил-пролін-ізомерази-циклофіліном А для підтримки реплікації HCV (10). Область III взаємодіє з основним білком HCV при ліпідних краплях і грає важливу роль в зборі вірусних часток (11-13).

Раніше лікування було стандартним інфіковані HCV пацієнти брали участь у щотижневих ін'єкціях пегільованого альфа-інтерферону (peg-IFN) в поєднанні з пероральним введенням RBV і одного HCV NS3 / 4A інгібітора протеази, боцепревіра або telaprevir (14). Побічні єфекти від IFN+RIB можуть бути важкими, включаючи депресію, грипоподібні симптоми і анемію (15-17). Боцепревір і телепревір є першими противірусними агентами прямої дії (DAA), які отримали дозвіл на  застосування при ВГС з препаратами інтерферонами та рибвиріном. Управління з контролю за продуктами і ліками (FDA) схвалили поєднання препаратів прямої дії без інтерферону для безпечного та ефективного лікування пацієнтів з HCV: інгібітор протеази ABT-450 з ритонавіром і інгібітором NS5A ombitasvir плюс інгібітор ненуклеозидні полімерази дасабувір. Більш того, новіший NS3 / 4A інгібітор протеази danoprevir (DNV) він дуже селективний і ефективний проти генотипа 1 HCV (18, 19). Було показано, що DNV безпечний і добре переноситься з невеликими побічними ефектами як монотерапія у пацієнтів, які не отримують лікування, та тих хто не відповів на терапію. Нещодавно був схвалений третій інгібітор протеази, сіміпревір FDA, тоді як було оголошено, що виробництво телапревіра вже припинено.  Софосбувір (SOF) являє собою інгібітор нуклеотидного аналога HCV NS5B полімерази, який діє як обмежувач ланцюга для пригнічення реплікації вірусного генома (20). SOF демонструє пан-генотипическую противірусну активность проти всіх генотипів HCV і має високий бар'єр резистентності тому, що він блокує висококонсерватівний NS5B центр вірусу гепатиту С (21). 6 грудня 2013 року FDA затвердив SOF як компонент комбінованого режиму противірусної терапії для хронічного гепатиту С. Daclatasvir (DCV) є одним з перших антивірусних препаратів з блокуванням центру NS5A вірусу гепатиту С  з пангеномною дією (22-25). Ledipasvir (LDV) є дуже активним NS5A- антивірусним препаратом, який зберігає повну активність проти NS3 / 4A і NS5B-резистентні штами HCV (26). LDV має ефект синергетичної противірусної активності, коли застосовується поєднанні з іншими класами DAA HCV (26). Комбінація SOF з LDV досягла високій швидкості стійкої вірусологічної відповіді (СВВ) для пацієнтів шо раніше лікувалися і пацієнтів хто не отримував лікування  з HCV-інфекцією (27, 28) і отримала схвалення FDA для лікування зараження генотипом HCV.  Для того щоб опредилити точну дію цих препаратів, характеризацію кінетичних профілів DAAs, використовують мультиплексну систему аналізу, яка включала проточну цитометрию, Gaussia luciferase, система Вестерн-блот-аналізу, зворотна транскрипційно-кількісну ПЛР (RT-qPCR), обмежений аналіз розведення, і аналіз профілювання зображення. Цей підхід демонструє що тільки інгібітори NS5A можуть мати статистично достовірну дозову реакцію на ефекти ліків в ранні моменти часу. інгібітори NS5A як було показано, мають ранній вплив на реплікацію, складання і інфекційність вірусу гепатиту С.  Дослідження і лікування ВГС вступили в нову еру з появою антивірусних препаратів прямої дії (DAA), які безпечні, доступні і мають коротку тривалість лікування для лікування HCV-інфекції майже у кожного паціента. Деякі з швидких досягнень нових терапевтичних засобів в лікуванні мають свою основу в математичному моделюванні, яке надало інструменти для швидкої оцінки ефектів нових антивірусних препаратів in vivo. Терміни, які спочатку використовувалися в якості математичних характеристик вірусної кінетики, такі як перша і друга фази вірусного занепаду, стали фразами, знайомими багатьом дослідникам і клініцистам в цій області.

Раніше терапевтичні стратегії лікування віруса гепатиту С (HCV)  виключно були - інтерферон (ІФН) та  рибавірин (RBV), але зараз увесь світ переходить до противірусних агентів прямої дії (DAA), прагнучи до стратегії виключення інтерферону та впровадження меншої тривалості лікування та зменшення кількості побічних ефектів. Для вивчення механізма дії та ефективності нових схем з  SOF, була проаналізована відносно вірусного навантаження когорта хворих на початку лікування та в динаміці схеми лікування ПЕГ - ІНФ+РIB+СОФ. Для цього аналізу, в якому використовується  блот-аналіз, зворотна транскрипція-кількісна ПЛР (RT-qPCR). Ми брали ці методи для оцінки  відносної ефективності схеми за кінетикою її противірусного ефекту для обгрунтування потенційної клінічної користі. Ми оцінили пангеномний інгібітор NS5В софосбувір в комплексі з ПЕГ - ІНФ+РIB+СОФ на протязі 12 тижнів.  

Наш аналіз може  полегшити вивчення біологічних процесів, пов'язаних з реплікацією HCV і може допомоги визначити оптимальні комбінації ліків.

Крім того, ми, як клініцисти, хочемо знати, як короткий період лікування при комбінації DAA може впливати на кінетику вірусного навантаження і стійку вірусологічну відповідь. Чи можемо ми вилікувати людей за допомогою 4 тижнів або 2 тижнів лікування? Які бар'єри для швидкого лікування? Як ми можемо оцінити, чи можна швидко вилікувати пацієнта або знадобитися тривала схема лікування?

Матеріали і методи.   Було проведено дослідження хворих на хронічний гепатит С, які були госпіталізовани у відділення вірусних гепатитів клініці  Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського НАМН України, в місті Києві, з січня 2016 по грудень 2017 р., для проведення наступного лікування протягом принаймні шести місяців з інтерфероном-альфа, з або без рибавірину, з використанням стандартних доз і способів введення та застосування софобувіру [29,30,31,32];  Ми застосовували стаціонарну медичну документацію для збору демографічних, антропометричних, епідеміологічних та клінічних даних, та інформацію  біопсії печінки, або неінвазивний тест. Ми визначили 124 історії хвороби пацієнтів з гепатитом протягом цього періоду. Попередній аналіз виключив гострі випадки гепатиту, ко-інфікуванні ВІЛ або HVB, HCV спонтанний кліренс, пацієнтів з тяжкою формою фіброзу за Child Phug стадія В та С.  Критерії включення були: 1 – попередня наявність гепатиту С протягом шести місяців відсутність протипоказань для лікування; 2 - біопсія печінки здійснюється протягом шести місяців до 1 року або інший неівазивний метод виявлення фіброзу та активності; 3 – відсутність попереднього лікування ХГС або рецидиву. Критерії виключення: 1 - хронічні захворювання печінки, не пов'язані з HCV; 2 - поточний алкоголь або незаконного зловживання наркотиками; 3 - застосування гепатотоксичних або імунодепресантів; 4 - иммунодепрессивное хвороба і ВІЛ-інфекції.

У хворих на ХГС визначалися маркери вірусних гепатитів – В: HвsAg - є поверхневим антигеном ліпопротеїном оболонки вірусу гепатиту В; НВеАg – серцевинний білок, кодується тим же геном що і НВсоreAg; анти-НBсоre total загальні антитіла є дуже важливим діагностичним маркером, як гострого, так і перенесеного гепатиту В, особливо при негативних результатах HBsAg. Використовується для ретроспективної діагностики; анти-HCV IgM, анти-HCV IgG. Метод виявлення імунохемолюмінисцентний. Матеріал - сироватка крові – 1 мл.

Біохімічні та клінічні аналізи крові виконували всім хворим на ХГС за загально-прийнятими в клінічній практиці методами. Оцінку фіброза та гістологічної активності проводили за загально прийнятною шкалою METAVIR [ ]. Методами якими були отриманні ці дані були: біопсія печінки («золотий стандарт» діагностики гістологічних змін печінки).

Біопсію печінки виконано у 10 хворих на етапі госпіталізації. Морфологічні дослідження печінки виконані на базі лабораторії патоморфології та цитології «Національного інституту хірургії та трансплантології імені О.О.Шалімова» НАМН України д.мед.н., проф. Гомоляко И.В. Статистичну обробку допомогав роботи науковий співробітник та програміст Національного Інституту ім. О.О. Шалімова  Швадчин І.О. Також використовували неінвазивні апаратні методи Fibroscan та эластометрія, та неівазивні лабораторні тести розробники Янченко В.І., Гомоляко І.В., Швадчин І.О. “FibroLiv”, “Fibrotest”, “AktiLiv”, “Aktitest”, “MorfoBioFibroTest” [32-35 ].

Фіброз та активність та їх якісна еволюція оцінювались шляхом порівняння стадії фіброзу та активності дослідження (до і після лікування),  трьома результатами: 1 - прогресування (після лікування бал більше, ніж до лікування ); 2 - стабілізації (після лікування стадія фіброзу або активності не змінилася); і 3 - регресія (стадія фіброзу та активності нижче, ніж до лікування).

Метою дослідження було виявити розподіл хворих з різними генотипами, вірусним навантаженням за фіброзом, активністю а також вплив лікування на фіброз та активність в залежності від відповіді на лікування.

Результати.

Кількість спостережень на початку лікування схемою софосбувір + пегінтерферон та рибавирін була 124 хворих за виміром кількість мо одиниць середнє значення вірусного навантаження склало у цих хворих 1млн.959 тис МО/мл, при цьому стандартне відхилення було 100,7 МО/мл, нижня межа довірчого інтервалу склала 2 млн 580 МО/мл, верхня межа 36 млн. 600 тис, медіана 3 млн 150 тис, мінімум 1000 тис МО/мл максимум 1100 млн МО/мл, нижня увартиль була 500 тис, верхня квартиль 9 млн МО/мл.

При проведенні більш детальної статистичної обробки були викинуті деякі показники для відтворення більш значущої статистичної моделі 4 показника, які сильно відрізнялись від інших показників.

Кількість спостережень на початку лікування схемою софосбувір + пегінтерферон та рибавирін була 120 хворих за виміром кількість мо одиниць середнє значення вірусного навантаження склало у цих хворих 6млн.610 тис МО/мл, при цьому стандартне відхилення було 9млн 540тис МО/мл, нижня межа довірчого інтервалу склала 4 млн 970 МО/мл, верхня межа 8 млн. 240тис, медіана 2 млн 600 тис, мінімум 1000 тис МО/мл максимум 43 млн МО/мл, нижня квартиль була 340 тис, верхня квартиль 8 млн МО/мл.

У чоловіків середнє вірусне навантаження становило 6 млн. 880 тис. зі стандартним відхиленням 10 млн.120тис, у жінок дещо менше 5 млн. 920 тис. зі стандартним відхилення 7  млн. 960 тис. Тобто можно зробити висновок, що достовірної різниці між чоловіками та жінками за вірусним навантаженням немає р ≥0,005.

В залежності від віку також була проаналізовано кількісне навантаження у хворих на ХГС.

До 25 років кількість хворих 10 пацієнтів мають середній рівень вірусного навантаження 5,85± 9,39 млн. МО/мл. Від 25 до 35 – 33 пацієнта вірусне навантаження склало 5,92± 9,6 млн. МО/мл. Від 35 до 45 років було 33 хворих з значенням кількості вірусу 10,11 ± 9,79 млн. МО/мл.  У хворих від 45 до 55 – 31 людина 11,07 ± 9,79 млн. МО/мл., більше 55 років 13,93 ± 9,53 млн. МО/мл.

В результаті статистичної обробки встановлено, що статистичної різниці між вірусним навантаженням та віком хворих немає р ≥0,005, але є тенденція до збільшення вірусного навантаження з віком хворих.

Наступним етапом було проаналізовано ступінь фіброзу та індексу гістологічної активності відносно хворих на ХГС.

Кількість хворих яка була з нульовим фіброзом це 25 середнє значення 5млн. 100 тис ±7млн.140тис, для хворих з мінімальним фіброзом 7млн.110тис. ±10млн.440тис., слабий фіброз вірусне навантаження було 8млн 730тис. ±11млн.610тис., для помірного фіброзу 8млн.560тис. ±10млн.440тис., для цирозу печінки 5млн.190тис. ±9млн.590тис.

Потім було виканоно статистичний аналіз на пошук достовірності різниці між показниками вірусного навантаження відносно фіброзу Таблиця 6.

Таблиця 6. Дисперсійний аналіз ANOVA вірусного навантаження в залежності від фіброзу

В результаті статистичної обробки встановлено, що статистичної різниці між вірусним навантаженням та фіброзом у хворих на ХГС немає р ≥0,005. Але при розробці ми бачимо, що при нульовому фіброзі воно нижче ніж при мінімальному, слабому, та помірному і цирозі, але при останньому воно нижче ніж при слабому, мінімальному та помірному.

При аналізі ІГА (індексу гістологічної активності) за Кнодель вона є мінімальна, слаба, помірна та висока ми бачимо наступне Табл.7.

Таблиця.7 Середнє значення показників вірусного навантаження відносно індекса гістологічної активності за Кнодель.  

В результаті статистичної обробки встановлено, що статистичної різниці між вірусним навантаженням та індексом гістологічної активності немає також вмкористовувався статистичний метод ANOVA у хворих на ХГС немає р ≥0,005.

Наступним етапом ми проаналізували динаміку вірусного навантаження у хворих на ХГС на лікуванні СОФ+ПЕГ-ІНФ+РІБ. Ми їі оцінювали на першому тижні, на другому та на 28 день терапії. Ми отримали наступні результати на першому тижні – другому тижні вірусне навантаження знизилось у 72% ( 86,0 ) хворих на 2,5 – 4,0 log., у деяких хворих 15% (18,0 ) воно не вимірювалось взагалі, у інших падіння було меншим. На 28 день терапії тільки у 2 хворих були позитивними якісні значення ПЦР. Один отримав (SVR12), а другий мав рецидив. Взагалі всі три рецидиви після лікування не можна пов’язати з вірусним навантаженням та їі кінетикою, тому що число їх дуже мале.

Висновки.

У чоловіків середнє вірусне навантаження дещо вище ніж у жінок, але не має статистичної різниці між ними p = 0,982

Немає статистичної різниці між вірусним навантаженням та розподілом віку хворих p=0,962, але є тенденція, шо при збільшенні віку хворих зростає середнє вірусне навантаження, що можливо пов’язано зі зниженням імунітету хворих.

При розгляді фіброзу немає залежності від вірусного навантаження та ступенем фіброзу, але при відсутності його та цирозі воно нижче ніж при 1,2 та 3 ступені. Статистичної достовірності немає p = 0,603.

ІГА (індекс гістологічної активності) не залежить від вірусного навантаження, та тенденцій немає p = 0,982.

Кінетика вірусного навантаження вже на першому та другому тижні лікування хворих схемою СОФ+ПЕГ-ІНФ+РІБ зменшується на 2,5-4,0 log у 72% хворих, а на 28 день вірус не виявляється у 98%,  що співпадає з даними літератури і говорить о високоефективності данної схеми.

Список літератури знаходиться у автора.

к. мед. н. Янченко В.І.