УДК: 616ю36-002+576.31

Дослідження зв’язків між морфологічними характеристиками печінки, генотипами ВГС і вірусним навантаженням у хворих на хронічний гепатит С

В.І.Янченко*, І.В.Гомоляко**, І.О.Швадчин**, С.В.Федорченко* Н.Є.Клочкова**

*ДУ Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім.Л.В.Громашевського АМН України, м. Київ

**Національний Інституту хірургії та трансплантології ім. О.О.Шалімова АМН України, м. Київ

Ключові слова: хронічний гепатит С, морфологічні зміни в печінці, індекс гістологічної активності, фіброз, вірусне навантаження, генотипи ВГС.

Вірус гепатиту С був вперше ідентифікований в 1989 році групою американських вчених під керівництвом M. Houghton. Вони клонували ДНК-копію віруса, який був збудником парентерального гепатиту ні-А-ні–В [1]. Це відкриття без сумніву мало надзвичайне клінічне значення. Вірус отримав назву «вірус гепатиту С» (HCV, ВГС) і з того часу почався період, який суттєво змінив погляди на гепатотропні віруси, їх сутність та клінічні прояви. Саме вірус ВГС приводить до розвитку хронічного гепатиту С (ХГС). З часом було встановлено, що популяція ВГС не є однорідною, а існує декілька їх генотипів; різним може бути і ступінь вірусного навантаження.

На сьогоднішній день залишається актуальним питання щодо впливу різних факторів, в тому числі і вірусологічних, на активність ХГС та прогресування фіброзу. Щодо вірусологічних факторів, таких як рівень РНК ВГС у сироватці і генотип ВГС, більшість авторів вказують на відсутність їх зв’язку з рівнем активності ХГС і рівнем прогресії фіброзу, оскільки в ході перехресних досліджень не була встановлена кореляції між серологічним рівнем РНК ВГС та активністю і фіброзом [2-5]. Хворі на ХГС з нормальними рівнями АлАТ в сироватці і морфологічними характеристиками печінки в межах норми могли мати високий рівень вірусного навантаження HCV RNA [6]. Але, слід зазначити, що рівень РНК ВГС в сироватці не є прямим відображенням внутрішньопечінкової реплікації ВГС, а кореляції між фіброзом і внутрішньопечінковим рівнем РНК ВГС не були належним чином досліджені [7]. Роль вірусного генотипу в патогенезі ХГС також недостатньо вивчена. В деяких ранніх дослідженнях було показано, що ВГС-генотип 1в спостерігається у осіб з найбільш важкими ураженнями печінки, включаючи вищу частоту цирозів і гепатоцелюлярних карцином [8]. Проте, в більшості цих досліджень не враховувались такі суттєві фактори, таких як вік, тривалість та джерело інфекції. Генотип 1в більш поширений серед літніх хворих і більш пов'язаний з поширенням переливань крові. У дослідженнях з урахувнням цих обставин хвороби кореляції між генотипом 1в і більш важким ураженням печінки не було знайдено [2,9]. Розподіл генотипів не відрізняється у хворих на ХГС з нормальним та підвищеним рівнем АлАТ [10]. В деяких дослідженнях було знайдено незначну кореляцію між високою гетерогенністю квазівидів і більш важким ураженням печінки при ХГС [11]. В одному з досліджень було показано, що гетерогенність квазівидів була менша у хворих з нормальними рівнем АлАТ у порівнянні з тими, хто мав підвищений рівень ферменту [12]. Неоднорідність отриманих даних свідчить, що в цій області залишається багато невирішеих питань, особливо це стосується вітчизняної гепатології. В Україні дослідження щодо квазівидової гетерогенності у природньому протіканні ХГС та її зв’язку з фіброзом печінки на проводились. В даному дослідженні було проаналізовано вплив вірусного навантаження та генотипу ВГС на морфологічні зміни в печінці у хворих на ХГС.

Мета роботи – визначити доцільність використання таких показників як генотип ВГС та вірусне навантаження при розробці неінвазивних тестів для оцінки ступеня ушкодження печінки при ХГС.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Було обстежено 133 хворих на ХГС. В групі дослідження переважали хворі чоловічої статі, середній вік хворих - 38,9±1,8 років; тривалість хвороби, встановлена на підставі клініко-епідеміологічних та анамнестичних даних знаходилась в межах від 4 до 16 і більше років. Антитіла до ВГС були виявлені на догоспітальному етапі під час планового обстеження, у більшості хворих була виявлена підвищена активність АлАТ та АсАТ, у інших - активність цих ферментів була в межах норми.

Біопсію печінки у хворих на ХГС виконували після ретельного УЗ-дослідження з вибором безпечного акустичного вікна. Біопсію печінки виконували зранку, через 1,5-2 години після легкого сніданку. Забір біоптату проводили в ділянці VIII-IX міжребір’я під контролем УЗ-датчиків голкою типу UNICUT діаметром 16-18G. Отриманий біоптат фіксували у 10 % розчині нейтрального формаліну для подальшого морфологічного дослідження. Після стандартної гістологічної обробки парафінові зрізи забарвлювали гематоксиліном-еозином, за методом Ван Гізон, азур II-еозином та ставили ШИК-реакцію. Детальні результати морфологічного дослідження наведені в попередніх публікаціях [13]. Вивчення морфологічних змін в печінці за наявності ХГС дає можливість оцінити вираженість та співвідношення дистрофічних, некротичних, запальних та регенераційних процесів.

Оцінку морфологічних змін проводили з використанням шкали R.G. Knodell з співавт. [14] та визначенням індексу гістологічної активності (ІГА): 0-відсутність активності; 1-3 бали – мінімальна активність; 4-8 балів – низька; 9-12 балів – помірна; 13-18 балів – значна. ІГА визначається наявністю некротичних, дистрофічних та запальних змін в печінці. Вираженість фіброзу оцінювали за шкалою МETAVIR: F0 - фіброз відсутній; F1- фіброз портальних трактів без наявності септального фіброзу; F2 –портальний фіброз з окремим порто-портальними септами, F3 – множинні септи (порто-портальні, порто-центральні та септальні зв’язки); F4 - цироз печінки.

Одночасно у хворих визначали генотипи ВГС та вірусне навантаження. Досліджувана група хворих розподілилась за генотипами наступним чином: генотип 1а виявлено у 1 хв. (0,7%), 1в – у 94 хв. (66,2%), 2 – у 2 хв. (1,4%), 2а – у 3 хв. (2,1%), 3 – у 1 хв. (0,7%), 3а – у 36 хв. (25,4%), 3ав – у 5 хв. (3,5%). Очевидним є суттєве переважання генотипів 1в та 3а, що відповідає даним літератури. Вірусне навантаження коливалось в межах від 3,55 до 18,0 млнкоп/мл.

Статистичний аналіз включав методи варіаційної статистики з визначенням середнього арифметичного та середнього квадратичного відхилення, оцінка достовірності отриманих результатів визначалася за непараметричним критерієм U Манна-Уїтні. При множинному співставленні груп для виявлення впливу досліджуваних факторів використовували метод дисперсійного аналізу ANOVA, метод Краскела-Уоллиса, медіаннний тест. Для статистичної обробки результатів використовували комп’ютерну програму “Statistica for Windows” (версія 10.0, “Stat Soft and Inc.” 1984-2015, USA).

Результати дослідження.

На першому етапі роботи вивчався зв'язок між вірусним навантаженням, ІГА і фіброзом печінки у хворих на ХГС. Характеристика вірусного навантаження відносно ІГА представлена в табл. І

Табл.1

Середні значення показника вірусного навантаження відносно ІГА у хворих на ХГС

Достовірні відмінності між групами та залежність між ІГА та вірусним навантаженням відсутні. В межах кожної групи існує велика варіабельність значень, що ще раз підкреслює відсутність залежності між цими параметрами. Відносно окремих складових ІГА була виявлена аналогічна закономірність.

Досліджені хворі мали незначний ступінь вираженості перипортальних та септальних некрозів (0-1-2 бали). При цьому середні значення вірусного навантаження склали 6,74 ± 9,72 млн.коп/мл, 3,55 ± 3,25 млн.коп/мл, 5,0 ± 0,0 млн.коп/мл, відповідно. Дисперсійний аналіз не встановив статистично достовірного зв’язку між наявністю некрозу та рівнем вірусного навантаження в усіх трьох досліджених групах (F=0,28, p=0,756).

Інтралобулярна дегенерація з інтралобулярними некрозами, осередками запалення або без них спостерігалась у всіх хворих на ХГС з вираженістю від 0 до 4 балів з частотою 0, 21,8%, 24,8%, 33,8%, 19,5% відповідно з вірусним навантаженням 0, 5,75 ±10,27 млн.коп./мл., 5,44±7,23 млн.коп./мл, 7,79± 10,36 млн.коп./мл, 7,0±10,04 млн.коп./мл. І в цьому випадку дисперсійний аналіз не дає підстав вважати виявлені незначні відмінності між групами статистично значущими (F=0,482, p=0,695), хоча деяка тенденція і спостерігається.

Дослідження зв’язків між вірусним навантаженням та вираженістю запальної інфільтрації також не виявило достовірних відмінностей. Розподіл різних за інтенсивністю запалення випадків (від 0 до 4 балів) був наступним: 0,75%, 21,8%, 14,3%, 45,1%, 18,5% і 18,0 млнкоп/мл, 6,07 ±10,02 млн.коп./мл, 6,86±10,97 млн.коп./мл, 6,06±8,3 млн.коп./мл, 7,93±10,73 млн.коп./мл відповідно. Загалом, отримані дані свідчать про відсутність статистично достовірних відмінностей між досліджуваними групами за результатами дисперсійного аналізу (F=0,574, p=0,682). Однак, спостерігається значна варіабельність величин вірусного навантаження незалежно від балу запалення. У одного хворого за відсутності запальної інфільтрації портальних просторів зареєстровано дуже високий рівень вірусного навантаження, тобто відсутність запалення не є гарантією відсутності вірусу.

Характеристика вірусного навантаження відносно фіброзу представлена в табл.2. Констатована відсутність достовірних відмінностей між різними групами хворих, а також між рівнем вірусного навантаження та фіброзом печінки, хоча спостерігається значна варіабельність показників.

Табл. 2

Середні значення показника вірусного навантаження відносно ступеня фіброзу у хворих на ХГС

Наступним етапом дослідження було визначення зв’язку між генотипом ВГС та морфологічними проявами ХГС. Було встановлено, що в групі дослідження суттєво переважали генотипи 1в та 3а - 66,2% і 25,4% відповідно, інші генотипи спостерігались в окремих випадках. На рис. 1 наведено залежність ІГА від генотипу ВГС. В цілому ушкодження печінки за цим показником достовірно не відрізняється (р=0,092), хоча існує певна незначна тенденція до зменшення інтенсивності ІГА при 3а генотипі. Так середнє значення ІГА для генотипу 1в (6,80±2,79 балів) більше ніж для генотипу 3а (6,03±2,66 балів). Результати проведеного дисперсійного аналізу також показали, що отримані статистичні характеристики (F = 3,656, р=0,058) хоча і максимально наближаються до статистичної достовірності, але суттєвими результати впливу генотипів 1в і 3а на ІГА вважати не можна.

Рис. 1. Значення ІГА в групах з різним генотипом вірусу гепатиту С.

Аналіз відносно головних морфологічних складових ІГА показав, що статистично достовірна залежність між генотипом вірусу та ступенем перипортального та септального некрозу відсутня (F = 0,0022 р = 0,9630). Але в даному випадку досліджувалась дуже невелика вибірка (5 % від загальної кількості хворих), оскільки некротичні зміни в печінці у 95 % хворих були відсутні, тому такий результат не є остаточним.

Інтралобулярна дегенерація з інтралобулярними некрозами, осередками запалення або без них спостерігалась у всіх хворих на ХГС з вираженістю від 0 до 4 балів. В табл. 3 представлено розподіл хворих на ХГС відносно генотипів ВГС та вираженості інтралобулярної дегенерації. За результатами розрахунків кореляційні зв’язки між ступенем дегенерації та наявністю 1в та 3а генотипів ВГС також встановлені не були, але спостерігаються чіткі тенденції. При інтралобулярній дегенерації вираженістю в 1 бал має місце збільшення частоти ВГС 3а генотипу, а при вираженості інтралобулярної дегенерації в 4 бали - 1в генотипу (1в генотип - 86,36 %, 3а генотип - 8,3 %). Тобто, відмічено розвиток більш тяжкого ураження печінки дистрофічним процесом у хворих з 1в генотипом.

Табл.3

Розподіл хворих на ХГС відносно генотипів вірусу гепатиту С та вираженості інтралобулярної дегенерації та некрозу печінки (%)

Відносно вираженості запальної інфільтрації портальних просторів в залежності від генотипу вірусу слід відмітити, що тенденція до стосувалась лише мінімальної та помірної запальної інфільтрації. Мінімальну інфільтрацію (1 бал) мали 17 хв. (18,1 %) з 1в генотипом і 12 хв. (33,3%) з 3а генотипом. Слабка запальна інфільтрація (2 бали) була виявлена у 14 хв. (14,9%) хворих з 1в і у 5 хв. (13,9 %) з 3а генотипом. Помірна запальна інфільтрація (3 бали) - у 46 хв. (48,9%) з 1в та у 12 хв. (33,3%) з 3а генотипом. Тяжка запальна інфільтрація (4 бали) - у 17 хв. (18,1%) та 7 хв. (19,4%) з 1в та 3а генотипами відповідно. Статистично достовірного зв’язку за критерієм χ2 Пірсона між генотипом ВГС та вираженістю запальної інфільтрації не встановлено, хоча присутня тенденція до переважання відсотка хворих з мінімальним запаленням при 3а генотипі.

Подальші дослідження були спрямовані на вивчення залежності між вираженістю фіброзних змін у печінці та генотипом ВГС. За даними літератури

при 1в генотипі спостерігається більш важкий ступінь ураження фіброзом і тому хворим з 1в генотипом, в першу чергу, рекомендують пункційну біопсію печінки для виявлення фіброзу. Результати дослідження вказаної залежності наведені в табл. 4. В цілому в досліджуваній групі хворих на ХГС з генотипом 1в середнє значення показника становить 1,50±1,41 бали, з генотипом 3а - 1,33±1,27 бали. Статистична достовірність впливу генотипу на рівень фіброзу не встановлена - F=0,387 р=0,535. Отримані дані співпадають з даними літератури і свідчать лише про наявність тенденції до збільшення вираженості фіброзу у хворих з 1в генотипом, а чіткий кореляційний зв’язок між генотипом вірусу та ступенем фіброзу печінки не виявлений.

Табл.4

Розподіл хворих на ХГС відносно генотипів вірусу гепатиту С та вираженості фіброзу печінки (%)

Висновки.

В результаті проведених досліджень було встановлено, що залежність між вірусним навантаженням та морфологічними змінами у печінці хворих на ХГС не є статистично достовірними. Суттєві відмінності між групами з різним рівнем ІГА та вірусним навантаженням відсутні. При цьому в межах кожної групи спостерігається виражена індивідуальна варіабельність показників вірусного навантаження незалежно від морфологічних характеристик печінки, а також відсутність зв’язку між показниками вірусного навантаження і окремими складовими ІГА. Так, високий рівень вірусного навантаження виявлено і при відсутності запальної інфільтрації портальних просторів. Аналогічна закономірність була встановлена і по відношенню до фіброзу печінки - достовірні відмінності між хворими з різним ступенем фіброзу та зв'язок з рівнем вірусного навантаження відсутні.

Вплив генотипу ВГС на морфологічні прояви ХГС більш помітні, існує певна незначна тенденція до збільшення інтенсивності ІГА при 1в генотипі ВГС, хоча в цілому зв'язок ушкодження печінки з цим показником статистично недостовірний, відсутній; отриманий результат (р=0,058) лише максимально наближає до статистичної достовірності вплив генотипів 1в і 3а на ІГА. При цьому дослідження окремих складових ІГА показало, що більш чіткі тенденція спостерігається відносно дегенеративних процесів і вона є менш вираженою відносно запальної інфільтрації. Вплив генотипу ВГС на рівень фіброзу також не встановлений, дані свідчать лише про наявність тенденції до збільшення вираженості фіброзу у хворих з 1в генотипом.

Відсутність достовірних відмінностей між рівнем вірусного навантаження, генотипом та морфологічними проявами ХГС свідчить про відсутність причинно-наслідкових зв’язків та недоцільності використання цих показників при створенні методів неінвазивної діагностики ХГС. При розробці діагностичних моделей для неінвазивного визначення ступеня ушкодження паренхіми печінки визначення генотипу ВГС має лише допоміжне значення і не входить до числа базових ознак.

Література

1. Isolaton of a DNA clone derived from blood – borne non A, non B viral hepatitis genome / Q-L. Choo, G. Kuo, A. J. Weiner et al // Science. – 1989. Vol. 244. – P. 359-362.

2. Poynard T, Bedossa P, Opolon P for the OBSVIRC, METAVIR, CLINIVIR, and DOSVIRC groups. Natural history of liver fibrosis progression in patients with chronic hepatitis C. Lancet 1997; 349: 825-832.

3. Poynard T, Ratziu V, Charlotte F, Goodman Z, Mchutchison J, Albrecht J. Rates and risk factors of liver fibrosis progression in patients with chronic hepatitis C. J Hepatol 2001;34:730-739

4. Ghany MG, Kleiner DE, Alter HJ, Doo E, Khokhar F, Park Y, Liang TJ, et al. Progression of fibrosis in early stages of chronic hepatitis C. HEPATOLOGY 2000; 32: 496A.

5. Alberti A, Boccato S, Ferrari A, Benvegnu L, Pontisso P, Noventa F, Gatta A. Outcome of initially mild chronic hepatitis C [abstract]. HEPATOLOGY 2001; 34: 225A.

6. Martinot-Peignoux M, Marcellin P, Gournay J, Gabriel F, Courtois F, Branger M, Wild AM, et al. Detection and quantitation of serum hepatitis C virus (HCV) RNA by branched DNA amplification in anti-HCV positive blood donors. J Hepatol. 1994; 20: 676-678.

7. Gervais A, Martinot M, Boyer N, Aupe´rin A, Le Breton V, Degott C, Valla D, et al. Quantitation of hepatic hepatitis C virus RNA with chronic hepatitis C, relationship with severity of disease, viral genotype and response to treatment. J Hepatol 2001;35:399-405.

8. Silini E, Bottellli R, Asti M, Bruno S, Candusso ME, Brambilla S, Bono F, et al. Hepatitis C virus genotypes and risk of hepatocellular carcinoma in cirrhosis: a case control study. Gastroenterology 1996; 111: 199-205.

9. Zeuzem S, Franka A, Lee JH, Herrmann G, Ru¨ster B, Roth WK. Phylogenetic analysis of hepatitis C virus isolates and their correlation to viremia, liver function tests, and histology. HEPATOLOGY 1996; 24:1003-1009.

10. Marcellin P. Hepatitis C: the clinical spectrum of the disease. J Hepatol 1999; 31: (suppl 1): 9-16.

11. Pawlotsky JM, Pellerin M, Bouvier M, Roudot-Thoraval F, Germanidis G, Bastie A, Darthuy E, et al. Genetic complexity of the hypervariable region 1 (HVR 1) of hepatitis C virus. Influence on the characteristics of the infection and the response to alpha-interferon therapy in patients with chronic hepatitis C. J Med Virol 1998;54:256-264.

12. Asselah T, Martinot M, Cazals-Hatem D, Boyer N, Aupe´rin A, Le Breton V, Erlinger S, et al. Hypervariable region 1 quasispecies in hepatitis C virus gentotype 1b and 3 infected patients with normal and abnormal serum alanine aminotransferase levels. J Viral Hepat 2002;9:29-35.

13. Гомоляко І.В. «Особливості морфологічних змін печінки у хворих на хронічний гепатит С» /, І.В. Гомоляко, В.І. Янченко, С.В. Федорченко, І.О. Швадчин, Н.Є Клочкова, Ю.Н. Капустін // Гепатологія – 2013. № 3 – С. 46-57.

14. Knodell RG, Ishak KG, Black WC, Chen TS, Craig R, Kaplowitz N,Kiernan TW, et al. Formulation and application of a numeral scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis. HEPATOLOGY 1981; 1:431-435.  

Исследование связей между морфологическими характеристиками печени, генотипами ВГС и вирусной нагрузкой у больных хроническим гепатитом С

В.И.Янченко, И.В.Гомоляко, И.А.Швадчин, С.В. Федорченко Н.Е. Клочкова

У 133 больных хроническим гепатитом С изучены зависимости между морфологическими изменениями в печени вирусной нагрузкой и генотипом ВГС. Характерна выраженная индивидуальная вариабельность показателей вирусной нагрузкой независимо от морфологических характеристик печени. Отсутствует статистически значимая связь между показателями вирусной нагрузки и ИГА, а также отдельными составляющими ИГА и фиброзом.

Установлена тенденция (р=0,058) к увеличению ИГА, выраженности его составляющих, особенно дистрофических изменений, и фиброза при 1в генотипі ВГС, хотя в целом связь между морфологическими изменениями в печени и генотипом статистически недостоверна.

Отсутствие корреляций между морфологическими проявлениями ХГС, генотипом ВГС и уровнем вирусной нагрузки делает нецелесообразным использование этих показателей при создании методов неинвазивной диагностики ХГС.

Ключевые слова: хронический гепатит С, морфологические изменения в печени, индекс гистологической активности, фиброз, вирусная нагрузка, генотипи ВГС..

Examination of correlation between the morphological characteristics of the liver, genotypes of HCV and viral concentration in patients with chromic hepatitis C

V.Ianchenko, І.Gomolyako, І.Shvadchin, S. Fedorchenko, N.Кlоtchkova

In 133 patients with chronic hepatitis С (CHC) we examined the correlation between the morphological changes in the liver, viral concentration and genotypes of HCV. The pronounced individual variability of indexes of viral concentration was typical independently of the morphological changes in the liver. The statistically significant correlation between indexes of viral concentration and the histological activity index (HAI), components of HAI and fibrosis was absent.

It was revealed the tendency (р=0,058) for rise of HAI, the expressiveness of its components, especially of dystrophic changes, and fibrosis in 1в genotypes of HCV, although correlation between the morphological changes in the liver and genotypes of HCV was not statistically significant. The absence of correlation between morphological manifestation of CHC, genotypes of HCV and viral concentration made not reasonable application of these indexes in creation of methods of noninvasive diagnostics of CHC.

Key words: chronic hepatitis С, the morphological changes in the liver, the histological activity index, fibrosis, viral concentration, genotypes of HCV.